グラム 染色 方法。 染色法|細菌の検査 各論|神奈川県衛生研究所

グラム染色試薬

グラム 染色 方法

概要 [編集 ] グラム染色によって細菌類は大きく2種類に大別される。 染色によって紫色に染まるものを 、紫色に染まらず赤く見えるものを という。 この染色性の違いはの構造の違いによる。 グラム陽性はが厚く、グラム陰性はペプチドグリカン層が薄く、さらにを有する。 そしてこの細胞壁の構造の違いは、この両者が生物学的に大きく違うことを反映しており、グラム染色は細菌を分類する上で重要な手法になっている。 は、その外膜がや粘液層で覆われた構造となっているものが多く、例外はあるものの、一般的な傾向としては相対的に病原性が高い。 このような構造は細菌細胞の抗原を隠しカモフラージュするように働く。 人間の免疫系は異物を抗原により認識するから、抗原が隠されると、侵入してきたものを人体が探知するのが難しくなる。 莢膜の存在はしばしば病原菌の毒性を高める。 さらに、グラム陰性菌は外膜にリポ多糖類であるを持っているが、これが炎症を悪化させ、ひどい場合には敗血症性ショックを引き起こすこともある。 は一般的には相対的にそれほど危険ではない。 これは人体がペプチドグリカンを持たず、従ってグラム陽性菌のペプチドグリカン層にダメージを与える酵素を作る能力を持っているからである。 また、グラム陽性菌はなどのに対する感受性が高いことが多い。 なお、こういった傾向に対する例外としてはやノカルジア菌などの・などが知られている。 を使って細菌の形態を観察することは、細菌を同定するための第一歩である。 しかし、に塗抹した細菌をそのまま観察しても細菌以外のものとの見分けが付きにくいため、通常は染色を施すことが多い。 グラム染色は二種類の色素を使って染め分ける点では、一種類の色素によるもの(単染色)より複雑な染色法であるが、その操作自体は比較的容易であり、しかも細菌の大きさ、形状、配列に加えて、グラム染色性(=細胞壁構造の違い)の情報まで得られる。 このため、細菌の鑑別の際にはまず最初に必ず行われる基本的な同定法である。 基本的な方法 [編集 ]• きれいなに、新しく分離培養した菌を含む菌液を、などで薄く曇る程度に塗抹し、乾燥後、の火炎中を2-3回通過させて固定する。 古い培養液では、グラム陽性菌であっても死んでしまっていて染まらない場合があるため、必ず新しく分離培養したものを用いる。 またはなどの塩基性の紫色色素液で1分程度染色する。 この段階では、菌はグラム陽性と陰性に関わらず紫色に染まる。 この処理で色素が不溶化される。 1分間水洗した後、過剰の水分を除く。 この段階でグラム陰性菌だけが脱色される。 ただちに水洗し、風乾する。 またはなどの赤色色素で1分程度染色する(対比染色)。 この処理で両方の菌は赤染されるが、グラム陽性菌は先に染めた紫色が残っているため変化はない。 乾燥後、で観察する。 は濃紫色、は赤色に染まって見える。 グラム染色で失敗する場合、その多くはエタノールによる脱色の過剰で、この場合グラム陽性菌が陰性に見えてしまう。 こうした判定のミスを予防するために、操作に慣れるまでは対照となる検体(例えばグラム陰性の対照に、グラム陽性の対照に)を同じスライドグラス上で一緒に染色して、染まり方を確認するのが薦められる。 後染色はサフラニンによる方法(Huckerの変法)が標準的であるが、サフラニンは一部の細菌の染色態度が良くないので、臨床診断で用いる場合には、可能ならばフクシンを用いることが推奨されている。 ベッドサイドや臨床検査部などではヨウ素処理と脱色を一つの液にまとめ、サフラニンをフクシンに代えた迅速法(商品名 フェイバーGなど)が用いられることが多い。 この場合、媒染脱色液はエタノールと同じ扱いになる。 染色態度はHuckerの変法に劣らず、かかる時間は短い。 染色原理 [編集 ] 真正細菌の細胞壁 これまでグラム染色性の違いは、細菌の細胞壁の構造によると考えられてきた。 グラム陽性菌の細胞壁が、一層の厚い層から構成されているのに対し、グラム陰性菌では、何層かの薄いペプチドグリカン層の外側を、と呼ばれる、(リポポリサッカライド LPS)を含んだが覆う形となっている。 このため、アルコールなどで処理すると、グラム陰性菌の外膜は容易に壊れ、また内部のペプチドグリカン層が薄いために、細胞質内部の不溶化した色素が容易に漏出して脱色される。 グラム陽性菌ではこの漏出が少なく、脱色されないまま色素が残る。 2015年にMichael J. Wilhelmらは、染色に用いられるクリスタルバイオレットは細胞質内部まで浸透出来ず、大部分がペプチドグリカン層にトラップされると説明している。 グラム陽性菌ではペプチドグリカン層が厚いため色素の漏出が少ないが、グラム陰性菌はペプチドグリカン層が薄く、エタノール洗浄で容易に色素が漏出、脱色しうる。 これは長い間考えられてきたグラム染色の原理に一石を投じるものであり、注目に値する。 なお、元から細胞壁を持たないやはグラム陰性である。 また、抗酸菌はグラム不定性を示すが、これは抗酸菌の細胞壁にと呼ばれる性の脂質が多く含まれているため、水溶性色素の浸透が悪いためである。 また、を作る菌では、芽胞の部分は染色されず透明に見える。 グラム染色性による分類 [編集 ] 代表的な細菌について、グラム染色の結果を示すと以下のようになる。 属(ブドウの房状に配列する。 、などが含まれる)• 属(直鎖状に配列、双球菌、4連、8連球菌など。 、などが含まれる)• 芽胞を作る菌:(、など)と(、など)• (など)• (、)• (ニキビの原因となるアクネ菌など)• (など)• (など)• (など)• (、、、、など)• (ただし、レジオネラはグラム染色では染色性が良くないので、微生物学的な同定にはヒメネス染色を用いる。 (など)• らせん状桿菌• (状形態をとる:、など)• 、スピリルムなど• リケッチア、クラミジアはにを欠く。 マイコプラズマはそのものを持たないため、染まらない。 グラム不定性• (分類上は放線菌に近くグラム陽性:、など) なお、グラム染色法自体は真正細菌以外の細胞にも行うことが可能であり、その場合、の有無によって染色性が決まる。 動物細胞はグラム陰性に、細胞や細胞はグラム陽性に染まる。 一般的なは、と呼ばれる細胞壁を持つがグラム陰性である。 その他、一部のシュードムレインを持つ古細菌(、など)や、大型の(ミミウイルス)もグラム陽性に染まる。 しかしながら、これらは真正細菌の細胞壁合成を阻害するなどのに対し非感受性である。 脚注 [編集 ] [] ウィキメディア・コモンズには、 に関連するカテゴリがあります。

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稔彦氏 当院は2003年に耳鼻咽喉科・アレルギー科として開業しました。 もともと実家が耳鼻科だったことから自然とこの道を志すようになり、加えて東洋医学の専門医も持っていることから、漢方にウエイトを置いた耳鼻科診療を志し開業しました。 平均的な耳鼻科開業医のスタイルで、花粉症、副鼻腔炎、中耳炎、外耳炎、耳垢除去、咽頭異物除去、めまい、耳鳴り、補聴器の相談など、地域住民のかかりつけとして日々診療しています。 雅子氏 患者さんは生後2か月の赤ちゃんから100歳を超えたお年寄りまで幅広く来院されます。 子ども好きな職員が多い影響もあるのか、子どもの来院が多いかもしれません。 最近、高齢者が増えたようにも感じているところです。 グラム染色に取り組もうと思われたきっかけを教えてください。 稔彦氏 私はもともと風邪には漢方が一番効くという考えでしたが、実際に診療を始めてみると、とくにお子さんで漢方薬は飲めないとよく言われました。 開院当初は患者さんが一日に数人しか来院しない状況でしたから、そのように言われることが続くと、こちらもだんだん診療に自信がなくなってきます。 それで徐々に抗菌薬を処方する機会が増えていきました。 雅子氏 私は開業当初は別の病院で薬剤師として勤務していましたが、開院からしばらくして当院を手伝うようになりました。 クリニックで勤めてみると、明らかに軽症な、鼻水は垂らしているけれど走り回れるほど元気な子どもたちに抗菌薬が次々と処方されることを目にして、果たしてこれほど抗菌薬が必要なのかということに疑問を抱くようになっていきました。 稔彦氏 その頃の私は、中耳炎や副鼻腔炎になったら即、抗菌薬と思っていて、どの抗菌薬を出すかで少し悩むくらいのものでした。 雅子氏 抗菌薬で症状が改善しないとその種類が変更されます。 そうすると、患児の保護者は「今日はまた別の薬ですがなぜですか?薬を飲んでもあまり変わらないように見えますが本当に必要なのでしょうか?」と私に説明を求めてくるのです。 風邪などの患者さんから「抗菌薬を飲んでいるのに治らない」と面と向かって言われるのは、重病で入院中の患者さんに「治らない」と言われるより私にとってショックでした。 また、当院独自のアンチバイオグラム表示ソフトを作成し、それを参考に抗菌薬を選択することもしてみました。 しかし、目に見える成果はあがらず、患者さんからは抗菌薬の効果を疑う不信の声も続きました。 こうして悩んでいた時、本当に偶然、感染症治療に関する動画を目にしました。 感染症コンサルタントで米国感染症専門医でもある、青木眞先生のセミナーです。 「その症状に抗菌薬は必要なのか?」という語りに目が釘付けになりました。 食い入るように見ていると、「グラム染色」が出てきたのです。 学生時代、実習で経験はあるものの、それは細菌検査室がやる検査と思っていました。 しかしグラム染色の結果は交通事故で言えば現場検証と同じ。 リアルタイムに外来で活用するのが基本だという話でした。 私は「これはすごい! うちのこの状況を打開するにはこれしかない!」と思いすぐ院長に相談したのです。 しかし、その時は強く反対され、導入には至りませんでした。 院長はグラム染色の導入に当初なぜ反対されたのですか? 稔彦氏 私ももちろん学生時代、グラム染色については習っています。 でも自分でグラム染色をして菌名まで推定できるというような教育は受けていません。 グラム染色は細菌学で分類の時に使う手法であって、臨床に活かせるようなものではないというイメージを持っていました。 それに、たとえば実施してみて間違えたら誰が責任を取るのか? ただでさえ患者さんが少ないのに、他院がしていないことをやり始めて変な噂が立ったらますます患者さんが減るのではないか? グラム染色を活用した診療を患者さんが受け入れてくれるのか? など、いろいろな不安が頭に浮かんでいました。 雅子氏 しばらくの間は、二人きりになるとその話になるのですが、結局、険悪なムードになって立ち消えます。 でも日々の服薬指導は相変わらず苦しい。 この状況が半年くらい続いた頃、今度は病院薬剤師会が主催された感染症の講演を聴講する機会がありました。 その講演で、病院勤務医の先生がグラム染色を実際に臨床に活かしていると話されたんです。 さらに、肺炎球菌とブドウ球菌のグラム染色像を示しながら、「慣れたら誰でも見分けがつく」とおっしゃっていました。 実は私も検査技師の資格は大学卒業時に取得していましたし、当院でエオジン染色(好酸球と好中球を見分ける検査)の担当はしていましたので、顕微鏡に抵抗はありません。 院長がしないならば私がやると言ったことでようやくOKが出て、一番安い顕微鏡を一台買ってもらい2004年の年末からトレーニングを始めたのです。 トレーニングはどのような方法で行いましたか? 雅子氏 耳鼻科には鼻水や耳漏の患者さんがたくさん来ますから、検体には事欠きません。 グラム染色で検査すると同時に検査センターに依頼し、それらの結果が一致するかどうか照らし合わせるというトレーニングを半年ほど行いました。 その間、院長が以前勤めていた病院の検査技師さんが耳鼻科でよく見る細菌の検体標本を見せに来てくれたり、私の昔の勤めていた病院に行って技師さんと一緒に、顕微鏡をのぞきながら教えていただいたりもしました。 講習会などに行くたびに感染症関連の先生方に色々質問もしました。 検査センターとほぼ一致した結果を出せるようになった段階で、少しずつ臨床に使ってもらえるようになりました。 トレーニングと並行してインターネットでも情報収集をしていました。 2007年にはグラム染色の専門サイトの管理者から県外で開催される新人微生物検査技師講習会をご紹介頂き、参加することができました。 そこでは、私たちがずっと気にしていたこと、とりわけ「そもそも鼻汁をグラム染色する意味があるのかどうか」について、微生物検査の専門家にご意見を聞きたいと思っていたんです。 稔彦氏 鼻汁をグラム染色するという報告は調べてもほとんど出てきません。 私も耳漏を培養検査に出すことは以前からありましたが、鼻汁ではしていませんでした。 鼻汁は外気に触れますから、あまり意味がないと考えていたのです。 雅子氏 それで相談してみたら、「意味あると思います。 微生物検査技師でも1日中鼻汁ばかり見ている人はいないのでデータがないだけです。 あなたがやってみたらどうですか」とおっしゃってくれたのです。 さらに「それで何かわかったら教えてくださいね」とも。 うれしかったですね。 モニターつきの顕微鏡を買い直すことに踏み切れたのは、この講習会のおかげです。 専門の技師さん達から励まされて「この方法を続けても良いんだ!」と思えたことが大きかったです。 導入にはどの程度のコストがかかりましたか? また、通常診療の中で、具体的にはどのような流れでグラム染色を行っているのでしょうか? 稔彦氏 グラム染色に必要な設備は、顕微鏡、検体採取用の綿棒、スライドガラス、吸引管、試薬だけです。 顕微鏡は安価な機種であれば10万程度で購入できますし、モニターをつけても100万はかかりません。 耳鼻科は日常的にエオジン染色を行っている施設も多いと思いますが、流し台さえあればグラム染色もできます。 医療従事者側の学びになりますし、患者さんへの指導にも役立つので、かかる費用以上に有用と感じています。 グラム染色を活用した診療ですが、下記の流れで行います( 図1)。

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グラム 染色 方法

スポンサーリンク グラム染色法とは? グラム染色法とは、細菌を分類するために行われる検査方法で、細菌を染色してその染まる色で2つにします。 グラム染色法によって紫色に染まるものをグラム陽性、紫に染まらず赤色に染まるものをグラム陰性と呼びます。 デンマークの学者ハンス・グラムによって発明されたのでこの名称になっています。 ただの名前由来であって、重さ g:グラム とは関係ありません。 グラム陽性菌と陰性菌の違い グラム染色法によって染まる色が二つに分かれるのは、細菌の細胞壁の構造の違いによります。 グラム陽性の細菌は、細胞壁が一層の厚いペプチドグリカン層からなっています。 グラム陰性の細菌は、何層かの薄いペプチドグリカン層とその外側に外膜と呼ばれる脂質二重層からなっています。 一般的にはグラム陰性菌の方が病原性が高いです。 それはペプチドグリカンを囲む外膜が、細菌の本体を隠してしまい、ヒトの免疫力が働きにくいこと、そして外膜自体が炎症を引き起こす毒素を持つためです。 すると、すべての細菌が紫色に染まります。 すると、グラム陰性菌はペプチドグリカン層が薄いのでアルコールによって中の成分が漏れ出てしまうので紫色が脱色されます。 無色に戻る グラム陽性菌は紫色が維持されています。 すると、脱色されたグラム陰性菌だけが赤く染まることになります。 細菌の分類について 染色された細菌を顕微鏡でのぞくと、色の違いで2種類に分けられます。 さらに細菌は丸い形の球菌と、細長い棒状または円筒状の形をした桿菌 かんきん の2種類に分けられます。 つまり、グラム染色法によって染色したあと顕微鏡で見ると、色と形によって、グラム陽性球菌、グラム陽性桿菌、グラム陰性球菌、グラム陰性桿菌の4つの種類に細菌を分類することができます。 分類される細菌の種類 以下、グラム染色法によって分類される細菌の名前とそれぞれの特徴をまとめました。 臨床的に重要なのは、グラム陽性球菌とグラム陰性桿菌です。 これらの菌は、病気を引き起こす原因菌になりやすいです。 グラム陽性球菌 ・化膿レンサ球菌 丸が鎖のようにつながった形。 のどや消化管などに存在し、溶連菌やとびひを引き起こす。 この菌の病原性が変化して発症する劇症型溶血性連鎖球菌感染症は壊死や多臓器不全を起こし命にかかわることがある。 この菌を人喰いバクテリアと呼ぶことがある。 ・肺炎球菌 のどに存在し、肺炎や髄膜炎を引き起こす。 肺炎球菌にはワクチンがある。 ・黄色ブドウ球菌 ブドウのような形状。 人や動物の皮膚などに存在し、食中毒、肺炎、髄膜炎、敗血症を引き起こす。 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 MRSA は、多くの抗生物質が効かなくなる。 MRSAではバンコマイシンがつかわれる。 ・腸球菌 病原性は低い。 しかし、耐性が問題。 MRSAに使用されるバンコマイシンに耐性を持ったバンコマイシン耐性腸球菌 VRE が存在する。 グラム陽性桿菌 ・ジフテリア菌 ジフテリア毒素を出すことでジフテリアという上気道の感染症を引き起こす。 四種混合ワクチンで予防。 ・枯草菌 土壌や植物や下水に存在し、ほとんど病原性はない。 しかし、結膜炎や虹彩炎を引き起こす。 納豆を作る時に使う細菌でもある。 ・炭疽菌 土壌に存在し、生物兵器としても使用されたことがある。 過去にはアメリカで炭疽菌事件が起きた。 ・ボツリヌス菌 土壌や海底に存在し、毒性の強いボツリヌス毒素を作り出す。 生物兵器としても利用される可能性のある毒素。 食中毒の原因にもなり、はちみつにも入っていることがある。 このため1歳未満の乳児にはちみつは与えてはいけない。 ・破傷風菌 土壌や汚泥に存在し、破傷風を引き起こす。 四種混合ワクチンで予防。 ・結核菌 昔は不治の病と言われていた。 結核を引き起こす。 空気感染する。 現在では薬で治療可能。 グラム陰性球菌 ・淋菌 のどや性器などの粘膜に存在し、性感染症を引き起こす。 ・髄膜炎菌 鼻やのどに存在し、髄膜炎を引き起こす。 グラム陰性桿菌 ・インフルエンザ菌 中耳炎や副鼻腔炎や気管支炎などを引き起こす。 インフルエンザウイルスとは異なる。 この菌には複数の種類があるが、敗血症や髄膜炎を引き起こすのはインフルエンザ菌b型 Hib:ヒブ。 これはヒブワクチン Hibワクチン で予防。 ・百日咳菌 百日咳を引き起こす細菌。 四種混合ワクチンで予防。 ・大腸菌 さまざまな種類の大腸菌がいる。 敗血症を引き起こす時もある。 しかし、通常の大腸菌は無害。 腸内にも存在。 尿道に入り込むと膀胱炎などの尿路感染症を引き起こす。 また大腸菌の中で病原性が強いのが病原性大腸菌O-157。 ベロ毒素と呼ばれるものを放出し腹痛や血便を引き起こす。 ・パラチフス菌 パラチフスという食中毒を起こす。 衛生環境が良好な日本ではあまり発症しない食中毒で、衛生環境の劣悪なアジアやアフリカで発生しやすい。 ・ペスト菌 致死性の高いペストを引き起こす原因菌。 ペストは黒死病とも呼ばれ14世紀に大流行したときは世界の人口が大幅に減少。 ・コレラ菌 コレラを引き起こす原因菌で、大量の下痢を伴い脱水状態に陥る。 ドラマJINでもこの細菌は登場して「コロリ」と呼ばれ多くの人が亡くなっていた。 ・腸炎ビブリオ 海水に存在し、この細菌に汚染された魚介類を生で食べることで食中毒を引き起こす。 ・緑膿菌 土壌、海水、淡水だけでなく腸内にも存在。 日和見感染症 抵抗力が下がっている人に起きる感染症 の原因になりやすい細菌で、院内感染を引き起こすこともある。 耐性もあり抗生物質が効きにくい菌でもある。 あらゆる抗生物質が効かない緑膿菌を多剤耐性緑膿菌 MDRP と呼ぶ。 ・レジオネラ菌 土壌や河川だけでなく温泉施設にも存在していることがある。 この細菌を吸い込むことでレジオネラ症という感染症を引き起こす。 マイコプラズマは? 細菌の中で一番小さいものがマイコプラズマです。 気道に感染し肺炎を起こすことがあります。 この菌は、細胞壁をもっていないためグラム染色陰性となります。 細胞壁をもたないため形状が定まりません。 そのため球菌でも桿菌でもありません。 コメント 普通の人は、グラム染色法、グラム陽性菌、グラム陰性菌なんて言葉は知らないと思います。 知る機会がないですからね。 それでも、自分が飲む抗生物質はどういう菌をやっつけるのかは知っておいても損はないです。 処方される抗生物質がどんな種類の菌をやっつけるのか? どれくらいの種類の細菌を退治するのか? そもそも、そこまで退治する必要があるのか? 抗生物質の中には、あらゆる細菌を退治してしまう 抗菌スペクトルが広い 薬もあります。 自分に処方された抗生物質の服用の重要性に気づくこともあるでしょうし、逆に不必要に処方された抗生物質に気づくこともあるかもしれません。 ちなみにグラム染色に関しては、以下の本がおすすめです。 読んでいておもしろかったです。

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